Содержание жирных кислот в сперматозоидах и семенной плазме как прогностические критерии успешной криоконсервации

Резюме

Существует недостаток информации о важности жирных кислот в составе мембран сперматозоидов и семенной плазмы человека в процедуре криоконсервации. Нашей целью было изучить возможную взаимосвязь между жирнокислотным составом сперматозоидов или семенной жидкости человека до замораживания и качеством спермы, которое оценивалось по жизнеспособности и подвижности до и после процедуры замораживания-размораживания. Другой целью данного исследования было определить наличие взаимосвязи между антиоксидантным потенциалом (АП) семенной плазмы, жирнокислотным (ЖК) составом и успешностью процесса криоконсервации. Была обнаружена значимая положительная корреляция содержания полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), ω3 ПНЖК и докозагексаеновой кислоты (ДГК) в сперматозоидах с жизнеспособностью и параметрами подвижности сперматозоидов до и после замораживания. Отрицательная корреляция с параметрами спермы была обнаружена для мононенасыщенных жирных кислот (МНЖК), отношения ω6/ω3, отношения насыщенные жирные кислоты/ПНЖК (НЖК/ПНЖК). Жирнокислотный состав семенной плазмы не был связан с жизнеспособностью.

Тем не менее, параметры подвижности до и после замораживания были связаны с содержанием стеариновой кислоты (С18:0) и ДГК. АП семенной плазмы положительно коррелировал с содержанием ПНЖК, ω3 и ДГК. С другой стороны, была обнаружена отрицательная корреляция между содержанием НЖК C22:0, С24:0 и МНЖК в семенной плазме и антиоксидантным потенциалом. АП положительно коррелировал с параметрами подвижности после размораживания. Мы описали значимую корреляцию между жирнокислотным составом сперматозоидов или семенной плазмы человека и параметрами образцов спермы после размораживания. Содержание ПНЖК, ω3 и особенно ДГК положительно коррелируется с подвижностью и жизнеспособностью сперматозоидов после замораживания/размораживания, а содержание МНЖК коррелируется отрицательно. Это означает, что в будущем жирнокислотный состав может быть использован как прогностический критерий пригодности для криоконсервации. С другой стороны, в дальнейшем можно разработать методики изменения липидного состава и/или антиоксидантного потенциала эякулята, чтобы сделать его более устойчивым в процессе криоконсервации.

Введение

Криоконсервация спермы человека представляет собой полезный терапевтический метод при лечении бесплодия с несколькими возможными способами применения (Anger et.al, 2003; Holoch & Wald, 2011). При криоконсервации сперматозоиды подвергаются физическому и химическому стрессу, что приводит к неблагоприятным изменениям в липидном составе мембран, подвижности и жизнеспособности сперматозоидов, а также состояния акросом (Alvarez & Storey, 1993; Hammadeh et al., 1999; Schiller et al., 2000; O’Connell et al., 2002). Все эти изменения уменьшают оплодотворяющую способность сперматозоидов человека после криоконсервации (Brotherton, 1990; Oehninger et al., 2000).

Считается, что механизмы криоповреждения сперматозоидов человека являются многофакторными. Некоторые авторы описывали непосредственное физическое повреждение структуры или функции спермы при замораживании клеток, связанное с образованием льда и высоким осмотическим давлением при замораживании (Mazur, 1984; Brotherton, 1990). С другой стороны, криоконсервация спермы связана с окислительным стрессом и образованием активных соединений кислорода (АСК) (Wang et al, 1997). АСК-индуцированное повреждение сперматозоидов проходит через стадию окислительной атаки бис-аллильных метиленовых групп полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), связанных с фосфолипидами спермы, что приводит к пероксидированию липидов и вызывает повреждение ДНК (Aitken, 1989; Agarwal et al., 2008). Для противодействия вредному воздействию АСК сперматозоиды и семенная плазма обладают рядом антиоксидантных систем, нейтрализующих АСК и предотвращающих повреждение клеток (Alvarez et al., 1987; Aitken, 1995; Gadea et al., 2011).

В семенной плазме присутствуют различные антиоксиданты и обеспечивают очень эффективную защиту от окислительного стресса (Argawal et al., 2006). Эта система включает такие ферменты, как каталаза, глутатионпероксидаза (ГП) или супероксиддисмутаза (СОД) и не ферментативные соединения, такие как глутатион (GSH/GSSG), ураты, аскорбиновая кислота, витамин Е, каротиноиды, убихиноны, таурин, гипотаурин, и т.д. (Li, 1975; Jeulin et.al., 1989; Therond et. al., 1996). Общий антиоксидантный потенциал (ОАП) семенной плазмы был определен как сумма антиоксидантов. Было показано, что низкий ОАП спермы связан с мужским бесплодием (Smith et al., 1996; Lewis et al., 1997; Lenzi et al., 2002; Tavilani et al., 2008). Было предложено использовать ОАП в качестве биохимического прогностического критерия мужской фертильности (Mahfouz et al., 2009; Adeel et al., 2012).

Хорошо известно, что липидный состав клеточных мембран сперматозоидов существенно влияет на функциональные характеристики сперматозоидов (Poulos & White, 1973; Alvarez & Storey, 1995; Zalata et al., 1998; Conquer et al., 1999; Lenzi et al., 2000; Gulaya et al., 2001; Lessig et al., 2004; Aksoy et al., 2006; Tavilani et al., 2006). Длинноцепочечные ПНЖК были обнаружены в высокой концентрации в сперматозоидах человека (Ahluwalia & Holman, 1969; Poulos & White, 1973), а доля этих ненасыщенных жирных кислот по отношению к насыщенным жирным кислотам и холестерину тесно связана с текучестью мембран сперматозоидов (Lenzi, 1996). Благодаря большому количеству двойных связей ПНЖК в мембранах сперматозоидов особенно восприимчивы к перекисному разрушению (Alvarez & Storey, 1995). Это имеет особенно важное значение при криоконсервации, когда увеличивается общее количество образовавшихся АСК (Wang et al., 1997) и меняется антиоксидантная система (Alvarez & Storey, 1992; Lasso et al., 1994; Gadea et al., 2011).

Липидный состав мембран представляет большой интерес по отношению к криоконсервации. Различия в содержании ПНЖК в составе мембран сперматозоидов были связаны с различиями в криотолерантности сперматозоидов разных видов диких животных (Miller et al., 2004, 2005). Некоторые предыдущие исследования человека и домашних животных показали изменения липидного состава клеточной мембраны и значительное сокращение содержания ω3 ПНЖК в процессе замораживания/размораживания (Alvarez & Storey, 1992; James et al., 1999; Schiller et al., 2000; Maldjian et al., 2005; Chakra- barty et al., 2007). Другие авторы показали, что замораживание/размораживание вызывало снижение текучести мембран (Giraud et al., 2000; Pena et al., 2004). Была описана взаимосвязь между липидным составом мембраны и параметрами сперматозоидов после размораживания в сперматозоидах кабана и жеребца (Waterhouse et al., 2006; Macias Garcia et al., 2011).

Тем не менее, отсутствует информация о важности жирнокислотного состава мембран сперматозоидов и семенной плазмы человека в процедуре криоконсервации. Насколько нам известно, это первое исследование, в котором сообщается о значимой корреляции между жирнокислотным составом сперматозоидов и семенной жидкости человека и качеством спермы после размораживания, которое оценивается по жизнеспособности и подвижности. Мы полагаем, что в будущем жирнокислотный состав может быть использован как прогностический критерий при оценке пригодности образца спермы для криоконсервации.

Еще одна цель данного исследования – определить, связан ли антиоксидантный потенциал (ОАП) семенной плазмы с жирнокислотным составом сперматозоидов и семенной плазмы, а также определить, существует ли непосредственная связь между ОАП семенной плазмы и успешностью процесса криоконсервации. Если эта взаимосвязь подтвердится, мы можем в дальнейшем разработать методику изменения липидного состава или антиоксидантного потенциала эякулята, чтобы сделать его более устойчивым к процессу криоконсервации.

Материалы и методы

Этика

Данное исследование было проведено по согласованию с Институтом Бесплодия Валенсии (Instituto Valenciano Infertilidad, IVI – Мурсия, Испания) и при наличии информированного согласия мужчин, посетивших центр для обследования на бесплодие.

Сбор образцов

Образцы спермы были получены у 64 пациентов (n = 192 образца эякулята, по три образца эякулята от каждого пациента с интервалом между отборами проб 5 недель), посещавших клинику для обследования на бесплодие. Образцы спермы были получены путем мастурбации и собраны в стерильные контейнеры после 3-5 дней воздержания от половой активности. После разжижения, образцы спермы были исследованы на объем, концентрацию, морфологию, жизнеспособность и подвижность сперматозоидов в соответствии с руководящими принципами ВОЗ, 2010 г.; пятое издание (ВОЗ, 2010).

Образцы были разделены на следующие группы: нормозооспермия (n = 103); олигозооспермия (n = 21); астенозооспермия (n = 25); олигоастенозооспермия (n = 31), в соответствии с критериями Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ , 2010).Образец считали олигозооспермическим в том случае, если общее количество сперматозоидов в эякуляте было ниже 39 х 10⁶, астенозооспермическим – когда процент подвижных сперматозоидов был ниже 32%.

Аликвоты каждого образца центрифугировали (3000 g в течение 10 мин), семенную плазму и сперматозоиды хранили при -80°C до определения антиоксидантного потенциала и жирнокислотного состава.

Криоконсервация образцов спермы

Образцы спермы были заморожены в гранулах на поверхности сухого льда с использованием криопротектора на основе глицерина с яичным желтком (Замораживающий агент – желточный буфер, Irvine Scientific, Санта Ана, Калифорния, США), как мы описывали ранее (Martinez-Soto et al., 2010).

Все полученные гранулы были помещены в криоскопическую пробирку, погруженную в жидкий азот, а затем немедленно транспортированы в банк спермы для долгосрочного хранения.

Процесс размораживания

Три гранулы на один образец (всего 150 мкл) были помещены в пробирки Falcon и выдержаны в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем еще 10 мин при 37°C без среды. Перед оценкой жизнеспособности и подвижности было добавлено 300 мкл среды (человеческий трубной жидкости, ЧТЖ, Irvine Scientific) с добавлением 10% сывороточного альбумина человека (САЧ; SAGE CooperSurgical, Трамбулл, Коннектикут, США) при 37°C (Martinez-Soto et al., 2011).

Параметры движения, измеренные с помощью компьютерного анализа спермы

Параметры движения были определены с использованием системы компьютерного анализа спермы (КАС) (ISAC, Валенсия, Испания) (Martinez-Soto et al., 2010, 2011). Были изучены следующие характеристики подвижности, полученные при помощи КАС: процент подвижности и поступательной подвижности, криволинейная скорость (VCL, мкм/с), скорость движения по прямой линии (VSL, мкм/с), средняя скорость движения по траектории (VAP, мкм/с), линейность криволинейной траектории (LIN, отношение VSL/VCL, %), прямолинейность (STR, отношение VSL/VAP, %), колебания криволинейной траектории (WOB, отношение VAP/VCL, %), амплитуда латерального смещения головки (ALH, мкм) и частота биения головки (BCF, Гц).

Каплю образца спермы объемом 7 мкл поместили на нагретое (37°C) предметное стекло и накрыли покровным стеклом 24 х 24 мм, что обеспечивает толщину слоя 10 мкм. Параметры настройки были следующими: скорость камеры 50 кадров/сек, оценка 100 кадров, на которых должны присутствовать по меньшей мере 25 сперматозоидов для подсчета. Изображения были получены при 200 -кратном увеличении на фазово-контрастном микроскопе (Nikon, Токио, Япония). Сперматозоиды с VAP < 10 мкм/с считались неподвижными. Оценивали не менее 5 полей для каждого образца, считая не менее 200 сперматозоидов в каждой подвыборке.

Анализ на жирные кислоты

Анализ на жирные кислоты в семенной плазме и сперматозоидах в образцах перед замораживанием проводился с использованием газовой хроматографии (Lepage & Roy, 1986). Аликвоты по 300 мкл семенной плазмы поместили в стеклянные пробирки для прямой переэтерификации. К каждому образцу добавили по 2 мл смеси метанола и бензола (4:1, об./об.) с внутренним стандартом (гептадекановая кислота, С17:0) и 0,01% бутилгидрокситолуола в качестве антиоксиданта. Образцы перемешивали с низкой скоростью, медленно добавляя 200 мкл ацетилхлорида в течение 2 мин. Затем образцы нагревали в течение 60 мин при 100°C в нагревательном блоке при непрерывном встряхивании. После того, как пробирки были охлаждены до комнатной температуры, было добавлено 5 мл 6% раствора (масс./об.) карбоната калия. Образцы перемешивали на вортексе в течение 30 сек и центрифугировали при 900 g в течение 20 мин при 15°С. Метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК), содержащиеся в верхней бензольной фазе, были помещены во флаконы для газовой хроматографии и хранились при 4°С до проведения хроматографического анализа.

В случае сперматозоидов, 2-10х10⁶ клеток разводили одним объемом фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБР) и центрифугировали при 900 g в течение 8 мин. Гранулу ресуспендировали в 400 мкл ФСБР. Затем аликвоты по 300 мкл суспензии сперматозоидов обрабатывали описанным ранее способом.

Анализ проводился на газовом хроматографе Varian CP-3900 (Varian Inc, Пало Альто, Калифорния, США), оборудованном пламенно-ионизационным детектором, используя модель капиллярной колонки CP9205-VF-WAXms (Agilent Technologies Espafia SL, Мадрид , Испания). Хроматограммы с временами удерживания и площадями пиков были получены с использованием записывающего интегратора и перенесены в электронном виде на компьютер для анализа, хранения и создания отчетов. Обозначения пиков и характеристики колонки были получены с испльзованием стандартной калибровочной смеси. Отдельные жирные кислоты были определены по порядку элюирования и по сравнению с известными коммерческими стандартами жирных кислот GLC 566-C (Nu-Chek Prep Inc., Элизиан, Миннесота, США).

Содержание каждого класса жирных кислот был выражено в молярных процентах от общего количества жирных кислот.Для более целостного сравнения различия в жирнокислотном составе, была рассчитана доля НЖК, мононенасыщенных жирных кислот (МНЖК) и ПНЖК, общее количество ω3 и ω6, отношения ω6/ω3 и НЖК/ПНЖК.

Измерения общего антиоксидантного потенциала семенной плазмы

Исследование ОАП (Rice-Evans & Miller, 1994) проводили с помощью коммерчески доступного набора для анализа на антиоксиданты (Cayman Chemical Company, Анн-Арбор, Мичиган, США) в соответствии с инструкциями производителя. Определение ОАП представляет собой колориметрический анализ, при котором измеряется общая антиоксидантная активность всех его составляющих. Анализ ОАП основан на способности молекул антиоксидантов связывать долгоживущие радикалы ABTS+, представляющие собой сине-зеленый хромофор с характерным поглощения при 750 нм, по сравнению с тролоксом, водорастворимым аналогом витамина Е, используемым в качестве стандарта для калибровки ОАП. Для проведения этого анализа 2,2'-азино-бис(3-этил-бензотиазолин-6-сульфонат (ABTS) инкубировали с мета-миоглобином и перекисью водорода для получения ABTS+. Количество полученного ABTS+ измеряли по оптической плотности с помощью микропланшетного ридера Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, S.A., Мадрид, Испания). Результаты выражали в виде концентрации тролокс-эквивалентов (нМ).

Статистический анализ

Сначала данные оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка для проверки нормальности распределения. Ввиду того, что большинство полученных данных имело негауссово распределение, был использован непараметрический тест.

Данные выражали как среднее значение ± SEM (стандартная погрешность средней величины). Для непосредственного сравнения пар значений использовали непараметрический знаково-ранговый критерий Уилкоксона. При сравнении групп образцов для всех попарных сравнений использовали критерии Крускала-Уоллиса и Коновер- Инмана.

Для изучения корреляции между результатами анализа липидов сперматозоидов и семенной плазмы до замораживания и качеством спермы до и после замораживания-размораживания был использован непараметрический критерий Спирмана.

Результаты

Параметры спермы до и после криоконсервации

Основные параметры спермы до и после криоконсервации приведены в Таблице 1. Криоконсервация связана со значительным уменьшением жизнеспособности, подвижности и большинства параметров движения, измеряемых с помощью КАС (Таблица 1, р <0,05).

Жирнокислотный состав сперматозоидов и семенной плазмы

Жирнокислотный состав сперматозоидов и семенной плазмы перед замораживанием приведены в Таблице 2. Жирнокислотный состав мембран сперматозоидов отличается от состава семенной плазмы по содержанию большинства анализируемых жирных кислот (Таблица 2, р <0,01). Более высокие значения содержания в мембранах сперматозоидов по сравнению с семенной плазмой были получены для ПНЖК, ω3 ПНЖК и ω6 ПНЖК, а более низкие значения содержания в мембранах сперматозоидов по сравнению с семенной плазмой – для НЖК, МНЖК, отношений ω6/ω 3 и ПЖК/ПНЖК (Таблица 2, p <0,01).

В мембранах сперматозоидов содержание НЖК составляет 46,7%, МНЖК – 15,1%, а ПНЖК – 38,1% от общего количества жирных кислот. В семенной плазме эти пропорции составили 62% для НЖК, 19,7% для МНЖК и 17,7% для ПНЖК. Это означает существенное различие соотношения НЖК/ПНЖК (1,32 в сперматозоидах и 3,7 в семенной плазме) и соотношения ω6/ω3 (0,97 в сперматозоидах и 2,76 в семенной плазме).

В сперматозоидах основными НЖК были пальмитиновая (С16:0) и стеариновая (С18:0) кислоты, в сумме они составили 90% от общего содержания НЖК. В семенной плазме кроме С16:0 и С18:0 следует отметить наличие арахиновой ( С20:0), бегеновой (С22:0) и лигноцериновой (C24:0) кислот. Основной МНЖК в сперматозоидах является олеиновая кислота (С18:1n9), которая составляет более 60% от общего количества МНЖК. В семенной плазме процентное содержание C18:1n9 было выше, чем в сперматозоидах, и составляло более 70% от общего содержания МНЖК (9,3% и 14,4%, соответственно, р <0,01).

Основной ПНЖК в сперматозоидах была докозагексаеновая кислота (ДГК, С22:6n3), которая составляла 50% от общего количества ПНЖК. Тем не менее, содержание ДГК в семенной плазме было достоверно ниже, чем сперматозоидах, и составило только 25% от общего количества ПНЖК.

Жирнокислотный состав сперматозоидов и семенной жидкости при нормо-, олиго-, астено- и олигоастенозооспермии.

Когда образцы были классифицированы в соответствии с (ВОЗ, 2010 г.) как нормозооспермические, олигозооспермические, астенозооспермические и олигоастенозооспермические, были найдены некоторые различия параметров спермы и жирнокислотного состава мембран сперматозоидов и семенной плазмы (Таблица 3).

Большинство оцениваемых параметров спермы имели различия между группами (р <0,01, Таблица 3а). Обнаружено снижение антиоксидантного потенциала семенной плазмы в олигозооспермической группе (олигозооспермические и олигоастенозооспермические образцы) по сравнению с нормозооспермической группой (р <0,01, Таблица 3а). В то же время для нормозооспермической и астеноспермической групп были получены близкие значения ОАП (р> 0,05, Таблица 3а).

В отношении жирнокислотного состава мембран сперматозоидов, нормозооспермические образцы показали более низкое содержание НЖК, чем образцы астенозооспермической и олигоастенозооспермической групп (Таблица 3б, p <0,05) и сопоставимые значения с олигоспермическими образцами. Содержание МНЖК в мембранах сперматозоидов нормозооспермической группы также было ниже, чем в других группах (Таблица 3б, p <0,05). Содержание ПНЖК в нормозооспермической группе был выше, чем в других группах (Таблица 3б, p <0,05). Это увеличение содержания ПНЖК было связано с увеличением содержания ω3 жирных кислот, главным образом, с более высокими содержанием C22:6n3 (ДГК) (Таблица 3б, р <0,05), в то время как содержание ω6 жирных кислот было близким во всех группах и находилось в диапазоне от 16,35 до 17,01%. Кроме того, в нормозооспермической группе значения отношеня ω6/ω3 и НЖК/ПНЖК были ниже, чем в других группах.

В семенной плазме подобная картина была обнаружена для значений нормозооспермической группы по сравнению с олигозооспермической и олигоастенозооспермической группами (Таблица 3в). Содержание МНЖК в нормозооспермической группе меньше, чем в олигоастенозооспермических образцах, в то время как содержание ПНЖК, общее количество ω3 жирных кислот и С22:6n3 (ДГК) в нормозооспермической группе было увеличено по сравнению с другими группами (Таблица 3в, р <0,05). Никаких различий между группами в отношении содержания НЖК не наблюдалось (Таблица 3в, р> 0,05). Мы не обнаружили значимых различий жирнокислотного состава семенной плазмы между астенозооспермической и нормозооспермической группами (Таблица 3в).

Корреляция между содержанием жирных кислот в сперматозоидах и семенной плазме и параметрами спермы перед замораживанием

Мы рассчитали коэффициент корреляции Спирмана между жирнокислотным составом сперматозоидов и параметрами спермы перед замораживанием (Таблица 4а, р <0,01). Наблюдалась значимая положительная корреляции между содержанием ПНЖК, общим содержание ω3, ДГК и арахидоновой кислоты (АК, С20:4n6) и параметрами спермы. С другой стороны, была обнаружена отрицательная корреляция между содержанием НЖК, МНЖК, общим содержанием ω6, отношением ω6/ω3, отношением НЖК/ПНЖК, содержанием некоторых специфических жирных кислот (С20:0, С18:1n9) и параметрами спермы (Таблица 4а, p <0,01). Морфология и общее количество сперматозоидов в эякуляте представляют собой параметры спермы, имеющие наибольшее количество значимых корреляций с содержанием жирных кислот.

Изучение корреляции между жирнокислотным составом семенной плазмы и параметрами спермы перед замораживанием показало, что жизнеспособность сперматозоидов в свежем образце перед замораживанием не связана ни с какими липидными параметрами (Таблица 4б, p > 0,05). Однако содержание С22:6n3 (ДГК) положительно коррелировало со всеми остальными исследуемыми параметрами спермы (Таблица 4б, р <0,01). Содержание МНЖК отрицательно коррелировало с морфологией и общим количеством сперматозоидов в эякуляте. Содержание ПНЖК и ω3 положительно коррелировало с общим количеством сперматозоидов. В то же время отношения ω6/ω3 и НЖК/ПНЖК отрицательно коррелировали с этим параметром.

Корреляция между содержанием жирных кислот в семенной плазме и сперматозоидах и антиоксидантным потенциалом в семенной плазмы

Общий антиоксидантный потенциал семенной плазмы составил в среднем 1703,08 ± 15,89 мМ (тролокс-эквивалент). ОАП положительно коррелировал с содержанием ПНЖК, общим содержанием ω6, содержанием С18:2n6t, С20:3n6, общим содержанием ω3 и содержанием C22:6n3 (ДГК) в семенной плазме (Таблица 5, р <0,01). В то же время содержание НЖК, C22:0, С24:0 и МНЖК в семенной плазме отрицательно коррелировало с антиоксидантным потенциалом (Таблица 5, р <0,01).

Однако при определении взаимосвязи жирнокислотного состава сперматозоидов и ОАП семенной плазмы мы обнаружили слабую корреляцию, противоположную аналогичной корреляции для жирнокислотного состава семенной плазмы. ОАП положительно коррелирует с содержанием НЖК и C22:2n6 в сперматозоидах и отрицательно коррелирует с содержанием C22:5n3 (Таблица 5, р <0,01).

Корреляция между содержанием жирных кислот в семенной плазме и сперматозоидах перед криоконсервацией и параметрами спермы после замораживания-размораживания.

Положительная корреляция между параметрами спермы в образцах, подвергшихся замораживанию-размораживанию, и жирнокислотным составом сперматозоидов и семенной плазмы показана в Таблице 6а и 6б.

Как было ранее описано для параметров спермы в образцах перед замораживанием, наблюдалась значимая положительная корреляция параметров спермы после размораживания с содержанием C22:6n3 (ДГК), ПНЖК и общим количеством ω3 в мембранах сперматозоидов. Отрицательная корреляция была найден для некоторых НЖК, таких как С16:0, С18:0, С20:0 и С22:0, МНЖК, отношений ω6/ω3 и НЖК/ПНЖК (Таблица 6а, р <0,01).

Жирнокислотный состав семенной плазмы не был связан с жизнеспособностью образцов после замораживания-размораживания (Таблица 6б, р> 0,05). Содержание некоторых жирных кислот, таких как C22:6n3 (ДГК), ω6, C18:0 и отношение ω6/ω3 положительно коррелируют с подвижностью и параметрами движения (Таблица 6б, р < 0,01). В то же время содержание C20:0, С22:0 и С20:5n3 отрицательно коррелирует с параметрами движения (Таблица 6б, р <0,01).

Для детального изучения согласованности ранее полученных корреляций оценивали корреляцию жирнокислотного состава сперматозоидов и семенной плазмы с изменением этих параметров качества спермы до и после замораживания-размораживания (Таблица 7а и б). Эти изменения были рассчитаны для каждого параметра спермы как значение для замороженного-размороженного образца/значение для свежего образца * 100. Несмотря на то, что уровень корреляции изменился в сторону более низких значений коэффициента корреляции Спирмана и р-значений по сравнению с корреляцией, рассчитанной с учетом только замороженных-размороженных образцов (данные представлены в Таблице 6а и б), в целом полученные данные согласуются.

Антиоксидантный потенциал семенной плазмы положительно коррелировал с некоторыми параметрами подвижности (Таблица 6б, р < 0,01). В частности, ОАП положительно коррелировал со средней скоростью движения по траектории (VAP) и линейной скоростью (VSL). Это означает, что эякуляты с более высоким антиоксидантным потенциалом семенной плазмы показали более высокую скорость сперматозоидов.

Жирные кислоты в мембранах сперматозоидов в хороших и плохих замороженных образцах

Образцы были разделены на группы хороших и плохих замороженных образцов в соответствии с криотолерантностью. Замороженные образцы считались хорошими, если подвижность сперматозоидов в замороженном образце была > 50% от подвижности в свежей сперме.

Хорошие замороженные образцы характеризуются более высокими значениями содержания ПНЖК, ω3 и ДГК, чем плохие замороженные образцы. С другой стороны, для них были обнаружены более низкие значение содержания НЖК, отношений ω6/ω 3 и НЖК/ПНЖК (Таблица 8, р <0,05).

Обсуждение

Замораживание связано с нарушением функций сперматозоидов, влияющих на процессы, необходимые для успешного оплодотворения ооцита in vivo и in vitro (Alvarez & Storey, 1993; Hammadeh et al., 1999; Schiller et al., 2000; O’Connell et al., 2002). Как и ожидалось, в этом исследовании мы наблюдали значительное снижение жизнеспособности и подвижности после замораживания. Считается, что механизмы криоповреждения сперматозоидов человека являются многофакторными, однако ранее было показано, что существенный вклад вносят такие факторы как избыточное образование АСК при замораживании и размораживании, а также окислительный стресс (Wang et al., 1997; Thomson et al., 2009). Были описаны два процесса, происходящие во время замораживания: (i) образование АСК, которые могут вызывать изменения в структуре и функции мембран (Wang et al., 1997; Chatterjee & Gagnon, 2001) и (ii) изменения в системе антиоксидантной защиты (Alvarez & Storey, 1992; Lasso et al., 1994; Gadea et al.,2011).

В сперматозоидах человека были обнаружены длинноцепочечные ПНЖК в высокой концентрации (Ahluwalia & Holman, 1969; Poulos & White, 1973). Благодаря большому количеству двойных связей, ПНЖК в мембранах сперматозоидов особенно восприимчивы к перекисной деструкции (Alvarez & Storey, 1995). Кроме того, ПНЖК в мембранах сперматозоидов обеспечивают большую пластичность, полезную при криоконсервации.

В этом исследовании мы изучили взаимосвязь между жирнокислотным составом и криотолерантностью образцов спермы.

Жирнокислотный состав сперматозоидов и семенной плазмы

Липидный состав мембран сперматозоидов существенно влияет на функциональные характеристики сперматозоидов (Zalata et al., 1998; Conquer et al., 1999; Lenzi et al., 2000; Gu- laya et al., 2001; Calamera et al., 2003; Lessig et al., 2004; Aksoy et al., 2006; Tavilani et al., 2006). Ранее некоторые авторы сообщали о высоком содержании ДГК и преобладании 16:0 и 18:0 среди НЖК сперматозоидов (Ahluwalia & Holman, 1969; Alvarez & Storey, 1992; Zalata et al., 1998; Aksoy et al., 2006). Содержание каждой отдельной жирной кислоты, найденное этими авторами, несколько отличается от наших результатов. Это можно объяснить различиями в методах обработки образцов спермы, используемых для анализа.

Мы подтвердили, что жирнокислотный состав мембран сперматозоидов и семенной плазмы, измеренный перед замораживанием, связан со структурой и функциями сперматозоидов. Так, нормозооспермические образцы имеют более высокий уровень ПНЖК и ω3, в частности, ДГА, чем образцы в группах с олигоспермией и астеноспермией, как было ранее показано в других исследованиях (Zalata et al., 1998; Conquer et al., 1999; Calamera et al., 2003). Мы показали, что значения ОАП семенной плазмы в нормозооспермических образцах выше, чем в олигоспермической и олигоастеноспермической группах; ОАП имеет близкие значение при астенозооспермии и нормозооспермии (Таблица 3a). Подобная ситуация наблюдается и для жирнокислотного состава семенной плазмы (Таблица 3в).Этот факт свидетельствует о высоком уровне корреляции между антиоксидантной способностью и жирнокислотным составом семенной плазмы, как показано далее в Таблице5. Напротив, взаимосвязь между ОАП семенной плазмы и жирнокислотным составом сперматозоидов менее тесная.

Результаты изучения взаимосвязи между жирнокислотным составом и параметрами спермы до замораживания аналогичны результатам предыдущих исследований. Во всех этих исследованиях содержание ДГК и ПНЖК положительно коррелирует, а содержание МНЖК отрицательно коррелирует с параметрами спермы; результаты относительно содержания НЖК противоречивы (Nissen & Krey- sel, 1983; Zalata et al., 1998; Aksoy et al., 2006; Tavilani et al., 2006). Тем не менее, жирнокислотный состав также зависит от потребляемой пищи (Conquer et al., 2000; Safarinejad, 2011; Attaman et al., 2012); этот факт может маскировать истинную взаимосвязь между содержанием жирных кислот и функциями спермы.

Наличие жирных кислот в семенной плазме может изменять функцию спермы путем изменения антиоксидантного статуса. Мы показали, что присутствие ПНЖК в семенной плазме положительно коррелирует с антиоксидантным потенциалом, в то время как содержание НЖК и МНЖК отрицательно коррелирует с антиоксидантным потенциалом семенной плазмы. Некоторые предыдущие исследования показали, что введение в рацион ω3 полиненасыщенных жирных кислот приводит к увеличению содержания глутатиона и активности супероксиддисмутазы (СОД) в сыворотке крови и снижению перекисного окисления липидов (Romieu et al., 2008). Подобным образом некоторые авторы сообщали о взаимосвязи между наличием ПНЖК и экспрессией гена, участвующего в различных механизмах, включая отклик на окислительный стресс и антиоксидантный потенциал (Lapillonne et al., 2004). Тем не менее, насколько нам известно, это первое исследование, в котором изучена корреляция содержания жирных кислот в семенной плазме с антиоксидантным потенциалом. Дальнейшие исследований должны подтвердить эти результаты и исследовать причины этой взаимосвязи.

Напротив, при оценке взаимосвязи между жирнокислотным составом сперматозоидов и ОАП семенной плазмы мы обнаружили слабую корреляцию, противоположную корреляции жирнокислотного состава семенной плазмы (Таблица 5). Ранее различные исследования оценивали взаимосвязь между жирнокислотным составом сперматозоидов и антиоксидантным потенциалом или активностью ферментов, присутствующих в семенной плазме, в результате чего были получены различные результаты (Calamera et al., 2003; Tavilani et al., 2008; Safarinejad et al., 2010).). Tavilani et al. (2008) сообщали о положительной корреляции между активностью СОД и содержанием полиненасыщенных жирных кислот в сперматозоидах. В то же время Safarinejad et al., 2010 отметили положительную корреляцию между содержанием ω3 жирных кислот в сперматозоидах и содержанием СОД и каталазы в семенной плазме (Safarinejad et al., 2010) и отрицательную корреляцию между содержанием ω6 жирных кислот в сперматозоидах и содержанием СОД и каталазы в семенной плазме. Calamera et al., 2003 предложили интересную точку зрения о том, что корреляция между содержанием ненасыщенных жирных кислот (МНЖК и ПНЖК) в сперматозоидах и антиоксидантной активностью СОД в нормозооспермических образцах отличается от корреляции для астено- или полизооспермические образцов; нормозооспермические образцы имеют более высокое содержание СОД.

С другой стороны, наличие некоторых жирных кислот может повлиять на образование АСК. Был отмечен интересный факт, что инкубация сперматозоидов человека в присутствии линолевой кислоты (С18:2n6) или ДГА эффективно стимулировала образование АСК сперматозоидами человека. Напротив, НЖК в сперматозоидах человека (С16:0 и С18:0) не оказывали влияния на образование АСК этими клетками (Aitken et al., 2006).

Жирнокислотный состав и криоконсервация

Липидный состав мембраны представляет значительный интерес в отношении криоконсервации (обзор Уайта (White, 1993)). При замораживании были обнаружены некоторые изменения в липидном составе. Alvarez & Storey сообщали о снижении содержания некоторых ЖК в сперматозоидах человека после замораживания, а именно о снижении содержания ПНЖК С18:2, С20:3, С20:4 и ДГК (C22:6N3) и повышении содержания НЖК C:16 и C:18 после замораживания (Alvarez & Storey, 1992). Позднее Schiller et al. (2000) подтвердили, что криоконсервация вызывала уменьшение содержания фосфатидилхолинов (16:0, 22:6 и 18:0, 22:6) и SM (16:0) и появление лизофосфатидилхолинов (16:0 и 18:0) и керамидов (16:0). Эти авторы предположили, что в результате цикла замораживания-размораживания в сперматозоидах человека происходит образование или активация фосфолипазы А2 и сфингомиелиназы (Schiller et al., 2000).

Эти изменения в липидном составе означают, что криоконсервация влияет на мембрану таким образом, что она становится более жесткой; в замороженных-размороженных сперматозоидах увеличивается средняя анизотропия по сравнению со свежей спермой (Giraud et al., 2000). Таким же образом криоконсервация вызывала снижение диффузии липидов в мембранах всех участков сперматозоидов (James et al., 1999).

По нашим данным это первое исследование, описывающее значимую корреляцию между жирнокислотным составом сперматозоидов или семенной плазмы человека и параметрами образцов спермы после размораживания. Мы подтвердили, что молярный процент ПНЖК и в особенности ДГК положительно коррелирует с функциональностью образцов спермы, подвергавшихся замораживанию-размораживанию.

Восприимчивость сперматозоидов к быстрому холодовому шоку ассоциировалась с высоким значением отношения мембранных жирных кислот ПНЖК/НЖК и низким уровнем холестерина в мембране сперматозоидов (White, 1993).

Поскольку ПНЖК могут влиять на текучесть мембран, не удивительно, что текучесть мембран является прогностическим критерием успешной криоконсервации у людей (Giraul et al., 2000). Giraul et al. (2000) сделали вывод о том, что «чем выше была текучесть мембран перед замораживанием, тем лучше была реакция сперматозоидов на криоконсервацию». Наши результаты подтвердили эту концепцию, поскольку содержание ПНЖК, ω3 и в особенности ДГК положительно коррелирует с подвижностью сперматозоидов и жизнеспособностью после замораживания/размораживания, а содержание МНЖК коррелирует отрицательно.

Вариации в содержании ПНЖК в мембранах сперматозоидов, в частности, докозапентаеновой кислоты (ДПК) и ДГК, ассоциируются с различиями в криотолерантности сперматозоидов различных видов диких животных, таких как азиатские и африканские слоны (Swain & Miller, 2000), обыкновенный вомбат, серый кенгуру и коала (Miller et al., 2004), а также голубых песцов и черно-бурых лисиц (Miller et al., 2005). С другой стороны, используя сперму кабана Waterhouse et al., 2006 продемонстрировали значимую зависимость между содержанием ДПК и ДГК в клеточных мембранах сперматозоидов после размораживания и коэффициентом выживаемости сперматозоидов, измеряемым по целостности клеточных мембран. Недавно сообщалось о корреляции между содержанием насыщенных жирных кислот в сперме жеребца с частотой повреждения мембраны сперматозоидов. Напротив, процент полиненасыщенных жирных кислот положительно коррелировал с количеством неповрежденных мембран после размораживания (Marcias Garcia et al., 2011).

Miller et al., (2005) предположили, что если наличие длинноцепочечных ПНЖК, таких как ДПК и ДГК, способствует увеличению текучести мембран сперматозоидов, то зависимость между успехом криоконсервации и текучестью мембран может быть двухфазной. На основании этой модели они предположили, что, во-первых, определенная степень текучести мембран может быть необходима для внедрения криопротекторов в мембраны сперматозоидов и может способствовать дегидратации перед криогенным замораживанием. Однако слишком высокая текучесть мембран также может угрожать целостности сперматозоидов (Miller et al., 2005).

Хорошо известны индивидуальные различия в пригодности спермы к криоконсервации (Centola et al., 1992). Однако возможные причины этого пока не достаточно хорошо определены. Некоторые исследования связывают различия между «хорошим» и «плохими» замороженными образцами с различиями в геномной ДНК (Thurston et al., 2002) и морфологией сперматозоидов; другой эффект связан с экспрессией генов (Thurston et al., 2001). Другие предполагают, что значение стабильности ДНК сперматозоидов после замораживания/размораживания связано с несбалансированным отношением содержания протамина-1 и протамина-2 (Gosalvez et al., 2011). В этом исследовании мы обнаружили различия в жирнокислотном составе между хорошим и плохим замороженными образцами. Тем не менее, нужны дальнейшие исследования, чтобы изучить, могут ли липидные различия, которые полностью зависят от генетических различий, быть использованы в качестве хорошего показателя криотолерантности в сочетании с другими параметрами спермы.

Выводы

Мы описали значимую корреляцию между жирнокислотным составом сперматозоидов или семенной плазмы человека и параметрами сперматозоидов в образцах после размораживания. Содержание ПНЖК, ω3 и особенно ДГК положительно коррелирует с подвижностью и жизнеспособностью сперматозоидов после замораживания/размораживания, а содержание МНЖК коррелирует отрицательно. Это означает, что в будущем жирнокислотный состав может быть использован в качестве прогностического критерия пригодности образца спермы для криоконсервации. Кроме того, в дальнейшем мы можем разработать методики изменения липидного состава или антиоксидантного потенциала эякулята, чтобы сделать его более устойчивым к процессу криоконсервации (Agarwal & Sekhon, 2010; Safarinejad, 2011; Zini & Al-Hathal, 2011).

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность Уильяму В. Холту, Университет Шеффилда, Великобритания (Willian V. Holt, The Univercity of Sheffield, UK) за критическое прочтение этой рукописи и ценные замечания. Мы также хотели бы поблагодарить Х.С. Доминго, Университет Барселоны, Испания ) (J.C. Domingo, Univervity of Barcelona, Spain) за оказание технической помощи по анализу жирных кислот.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов, в том числе каких-либо финансовых, личных или других отношений с другими людьми или организациями, которые могут оказать неуместное влияние или быть восприняты как оказывающие такое влияние на их работу. Институт Бесплодия Валенсии и Университет Мурсии оказывали финансовую поддержку при проведении исследований и/или подготовке статьи.

Авторство

J.C.M.S. и J.G. разработали и провели исследование; J.L. провел отбор пациентов; J.G. проанализировал данные и написал рукопись. Все авторы участвовали в интерпретации данных и комментировали статью.

Таблица 1 Основные параметры спермы до и после криоконсервации. Данные показаны в виде средних значений ± SEM (стандартная погрешность) и сравниваются с использованием непараметрического знаково-рангового критерия Уилкоксона.

Параметр	Свежая	После замораживания-размораживания	p-значение
Возраст	35,44 ± 0,37
Объем (мл)	3,42 ± 0,11
Концентрация сперматозоидов (10⁶ клеток/мл)	30,25 ± 1,82
Нормальная морфология (%)	4,18 ± 0,22
Жизнеспособность (%)	85,53 ± 0,83	36,93 ± 1,89	<0,01
Подвижность (%)	40,42 ± 1,51	20,30 ± 1,17	<0,01
Поступательная подвижность (%)	33,76 ± 1,43	16,73 ± 1,02	<0,01
VCL	51,03 ± 0,97	47,51 ± 1,31	<0,01
VSL	27,30 ± 0,68	29,52 ± 1,10	0,73
VAP	35,95 ± 0,69	34,87 ± 1,09	0,09
LIN	53,83 ± 0,71	61,38 ± 1,13	<0,01
STR	72,90 ± 0,67	80,67 ± 0,91	<0,01
WOB	72,38 ± 0,46	73,64 ± 0,81	0,13
ALH	2,10 ± 0,04	1,80 ± 0,04	<0,01
BCF	7,41 ± 0,10	8,05 ± 0,17	0,21

КАС: Компьютерный анализ спермы, VCL: криволинейная скорость, VSL: прямолинейная скорость, VAP: средняя скорость движения по траектории, LIN: линейность криволинейной траектории, STR: прямолинейность, WOB: колебание (VAP/VCL), ALH: амплитуда бокового смещения головки,BCF: частота биения головки.

Таблица 2 Жирнокислотный состав сперматозоидов и семенной плазы человека перед замораживанием. Содержание жирных кислот приведено в молярных процентах. Данные показаны в виде средних значений ± SEM (стандартная погрешность) и сравниваются с использованием непараметрического знаково-рангового критерия Уилкоксона.

Жирная кислота		Сперматозоиды	Семенная плазма
Миристиновая кислота	C14:0	0,92±0,09	0,46±0,04*
Миристолеиновая кислота	C14:1	0,11±0,03	0±0
Пальмитиновая кислота	C16:0	28,87±0,45	30,52±0,16*
Пальмитолеиновая кислота	C16:1	1,27±0,10	0±0*
Стеариновая кислота	C18:0	13,35±0,18	15,94±0,18*
Вакценовая кислота	C18:1n7	2,57±0,07	1,55±0,03*
Олеиновая кислота	C18:1n9	9,33±0,43	14,43±0,2*
Линолевая кислота (ЛК)	C18:2n6c	5,67±0,13	2,85±0,09*
Линолевая кислота (ЛК)	C18:2n6t	1,2±0,14	1,47±0,15*
α-линоленовая кислота (АЛК)	C18:3n3	0,81±0,10	0,59±0,07
γ-линоленовая кислота	C18:3n6	0,95±0,11	1,67±0,1*
Стеаридоновая кислота (СДК)	C18:4n3	0,30±0,07	0,09±0,01
Арахиновая кислота (АК)	C20:0	1,24±0,09	5,16±0,08*
Эйкозеновая кислота	C20:1n9	0,81±0,05	1,47±0,07*
Эйкозандиеновая кислота	C20:2n6	1,50±0,07	0,32±0,03*
Эйкозантриеновая кислота (ЭТЕ)	C20:3n3	0±0	0±0
Дигомо-гамма-линоленовая кислота (ДГЛК)	C20:3n6	3,42±0,08	2,28±0,05*
Арахидоновая кислота (AК)	C20:4n6	2,73±0,11	3,34±0,06*
Эйкозапентаеновая кислота (ЭПК)	C20:5n3	0,43±0,08	0,01±0,01
Бегеновая кислота	C22:0	0,90±0,10	6,1±0,1*
Эруковая кислота	C22:1n9	0,05±0,03	0±0
Эйкозендиеновая кислота	C22:2n6	1,21±0,15	0,43±0,05
Эйкозентриеновая кислота	C22:3n3	0,04±0,01	0,06±0,01*
Докозатетраеновая кислота	C22:4n6	0±0	0,18±0,02*
Докозапентаеновая кислота (ДПК)	C22:5n3	0,84±0,05	0,07±0,01*
Докозапентаеновая кислота	C22:5n6	0±0	0±0
Докозагексаеновая кислота (ДГК)	C22:6n3	19,01±0,65	4,28±0,17*
Лигноцериновая кислота	C24:0	1,42±0,09	4,46±0,08*
Ацетэруковая кислота	C24:1n9	1,01±0,05	2,25±0,04*
Насыщенные жирные кислоты	НЖК	46,71±0,58	62,63±0,27*
Мононенасыщенные жирные кислоты	МНЖК	15,14±0,45	19,71±0,24*
Полиненасыщенные жирные кислоты	ПНЖК	38,14±0,68	17,66±0,34*
Омега-3 жирные кислоты	Общ. ω3	21,45±0,69	5,11±0,17*
Омега-6 жирные кислоты	Общ. ω6	16,69±0,24	12,55±0,23*
Отношение содержания омега-6/омега-3 жирных кислот	ω6/ ω3	0,97±0,06	2,76±0,10*
Отношение содержания насыщенных/полиненасыщенных жирных кислот	НЖК/ПНЖК	1,32±0,05	3,73±0,08*

*p=0,05

Таблица 3 (а) Параметры спермы и жирнокислотный состав мембран сперматозоидов человека в образцах спермы, разделенных на классы в соответствии с ВОЗ, 2010: нормозооспермический, олиго-, астено- и олигоастенозооспермический. (б) Жирнокислотный состав мембран сперматозоидов перед замораживанием, (в) Жирнокислотный состав семенной плазмы перед замораживанием. Данные представлены в виде средних значений ± SEM и сравниваются с использованием непараметрического критерия Крускала-Уоллиса и критерия Коновер-Инмана для всех попарных сравнений

	Нормозооспермия (n = 107)	Олигозооспермия (n = 21)	Астенозооспермия (n = 25)	Олигоастенозооспермия (n = 31)
(a)
Подвижность (%)	52,34±0,80^a	51±1,88^a	25,26±1,93^b	18,9±1,72^b
Жизнеспособность (%)	89,1±0,66^a	84,44±1,95^b	81,6±2,39^b	76,52±3,28^b
Морфология (%)	4,83±0,31^a	3,72±0,46^a	3,54±0,48^a,^b	2,56±0,36^b
Объем	3,46±0,14^a	2,65±0,21 ^b	4,51±0,36^c	2,96±0,26^a,b
Концентрация	43,34±2,23^a	7,51±1,32^b	25,83±3,45^c	6,45±1^b
Общее количество сперматозоидов	144,19±9,11^a	16,47±2,34^b	109,81±15,65^c	15,91±2,29^b
ОАП	1710,23±27,85^a	1678,49±37,68^b	1765,01±34,86^a	1625,07±37,92^b
(б)
C22:6n3	22,39±0,72^a	15,31±2,15^b	17,50±1,06^b	13,64±1,33^b
НЖК	45,82±0,64^a	46,34±2,04^a,b	48,8±1,43^b	48±1,63^b
МНЖК	12,87±0,46^a	17,72±1,09^b	14,95±1,26^c	19,52±1,07^b
ПНЖК	41,31±0,7^a	35,94±2,3^b	36,24±1,25^b	32,48±1,63^b
Общее содержание ω3	24,58±0,79^a	18,93±2,35^b	19,55±1,07^b	16,13±1,58^b
Общее содержание ω6	16,73±0,33^a	17,01±0,75^a	16,7±0,67^a	16,35±0,64^a
ω3/ω3	0,77±0,05^a	1,17±0,14^b	0,9±0,06^b	1,41±0,2^b
НЖК/ПНЖК	1,14±0,04^a	1,49±0,2^b	1,39±0,08^b	1,65±0,14^b
(в)
C22:6n3	4,66±0,19^a	3,11±0,31 ^b	4,68±0,5^a,b	3,39±0,45^a,b
НЖК	62,47±0,34	63,78±1,23	61,61±0,48	63,46±0,65
МНЖК	19,35±0,3^a	20,11±1,03^a,b	19,65±0,46^a,b	20,62±0,64^b
ПНЖК	18,18±0,44^a	16,12±0,83^b	18,74±0,71^a	15,92±0,93^b
Общее содержание ω3	5,39±0,19^a	4,01±0,52^b	5,73±0,48^a	4,28±0,49^b
Общее содержание ω6	12,79±0,33^a	12,11±0,5^a	13±0,37^a	11,64±0,58^a
ω3/ω3	2,53±0,09^a	3,58±0,44^b	2,57±0,24^a	3,2±0,27^b
НЖК/ПНЖК	3,59±0,1^a	4,11±0,29^a,b	3,39±0,14^a	4,28±0,26^b

Числа в колонках с разными верхними индексами отличаются (p < 0,05)

Таблица 4 Коэффициент корреляции Спирмана между жирнокислотным составом (а) сперматозоидов человека, (б) семенной плазмы, измеренным перед замораживанием, и параметрами спермы перед замораживанием (p < 0,01)

	Подвижность	Жизнеспособность	Морфология	Общее количество сперматозоидов
(a)
НЖК	-0,22	-0,20	-0,12	-0,22
C16:0	-	-	-	-
C18:0	-	-	-	-0,24
C20:0	-0,22			-0,44
C22:0			-0,27
МНЖК	-0,32	-0,11	-0,26	-0,63
C18:1n7			0,24
C18:1n9	-0,30	-	-0,29	-0,58
ПНЖК	0,36	0,23	0,23	0,57
Общ. ω6	-	-0,24	-0,19	-
C18:2n6c		-0,26	-0,25
C20:3n6				0,42
C20:4n6	0,19	0,25	0,28	0,37
Общ. ω3	0,43	0,28	0,27	0,63
C20:5n3				0,19
C22:6n3	0,44	0,28	0,26	0,67
ω6/ω3	-0,42	-0,31	-0,32	-0,58
НЖК/ПНЖК	-0,31	-0,24	-0,19	-0,44
(b)
НЖК	-	-	-	-
C16:0	-	-	-	-
C18:0	0,22
C20:0
C22:0				-0,18
МНЖК	-		-0,25	-0,21
C18:1n7
C18:1n9				-0,20
ПНЖК	-			0,27
Общ. ω6	-
C18:2n6c	-	-	-	-
C20:3n6	-	-	-	-
C20:4n6	-	-	-	-
Общ. ω3	-			0,30
C20:5n3				0,19
C22:6n3	0,19	-	0,22	0,52
ω6/ω3	-			-0,23
НЖК/ПНЖК	-			-0,26

Таблица 5 Коэффициент корреляции Спирмана между жирнокислотным составом сперматозоидов или семенной плазмы и общим антиоксидантным потенциалом (ОАП) семенной плазмы

	Семенная плазма – антиоксидантный потенциал	Сперматозоиды – антиоксидантный потенциал
НЖК	-0,22	0,23
C22:0	-0,22
C24:0	-0,26
МНЖК	-0,19
ПНЖК	0,30
Общее к-во ω6	0,25
C18:2n6t	0,25
C20:3n6	0,20
C22:2n6		0,24
Общее к-во ω3	0,28
C22:5n3		-0,28
C22:6n3	0,33
НЖК/ПНЖК	-0,30

Таблица 6 Коэффициент корреляции Спирмана липидного состава (а) сперматозоидов и (б) семенной плазмы, измеренного перед замораживанием, с жизнеспособностью и подвижностью сперматозоидов после замораживания-размораживания (p < 0,01)

	Жизне-способность	Подвижность	Поступательная подвижность	VCL	VSL	VAP	LIN	STR	WOB	ALH	BCF
(a)
НЖК									-0,22
C16:0									-0,22	-026
C18:0	-0,37
C20:0			-0,22		-0,23		-,025	-,026	-0,25
C22:0	-0,37	-0,24	-0,24		-0,24	-0,23					-0,22
МНЖК	-0,39	-0,31	-0,31	-0,31	-0,35	-0,35				-0,25	-0,28
C18:1n7				-0,21
C18:1n9	-0,46	-0,28	-0,28	-0,31	-0,35	-0,35				-0,26	-0,29
ПНЖК	0,30	0,32	0,37		0,32	0,31	0,26		0,33
Общ. к-во ω6
C18:2n6c
C20:3n6
C20:4n6				0,32	0,29	0,30				0,26	0,30
Общ. к-во ω3	0,43	0,38	0,41		0,28	0,28	0,23		0,31
C20:5n3									0,22
C22:6n3	0,43	0,41	0,45		0,28	0,29	0,20		0,28
ω 6/ ω 3	-0,44	-0,35	-0,35			-0,20
НЖК/ ПНЖК		-0,28	-0,32		-0,22	-0,21	-0,27		-0,34
(b)
НЖК	-	-
C16:0	-	-
C18:0		0,43	0,44		0,23		0,27	0,27	0,26
C20:0		-0,31	-0,31	-0,25	-0,24				-0,25
C22:0		-0,25	-0,25
МНЖК	-										-0,23
C18:1n7	-
C18:1n9	-
ПНЖК	-
Общ. к-во ω6	-						0,28	0,27	0,29		0,25
C18:2n6c
C20:3n6								0,25
C20:4n6	-		0,24
Общ. к-во ω3
C20:5n3		-0,25	-0,23
C22:6n3	-	0,30	0,30		- -	-			0,24
ω 6/ ω 3	-				0,23			0,24			0,23
НЖК/ ПНЖК	-
ОАП					0,24	0,23		0,24			0,29

Таблица 7. Коэффициент корреляции Спирмана липидного состава (а) сперматозоидов (б) семенной плазмы, измеренного перед замораживанием, и изменения жизнеспособности и подвижности перед и после замораживания-размораживания (p < 0,01)

	Жизнеспособность	Подвижность	Поступательная подвижность	VCL	VSL	VAP	LIN	STR	WOB	ALH	BCF
(a)
НЖК									-0,21
C16:0	0,30								-0,23		0,29
C18:0		-0,21		-0,22		-0,22
C20:0	0,22	-0,23	-0,25	-0,24	-0,37	-0,30	-0,22		-0,23		-0,23
C22:0		-0,24	-0,24								-0,28
МНЖК	-0,33	-0,23	-0,22								-0,37
C18:1n7
C18:1n9	-0,38										-0,39
ПНЖК		0,28	0,29		0,24	0,23			0,26
Общ. к-во ω6
C18:2n6c	-0,26				0,22
C20:3n6					0,21			0,236			0,27
C20:4n6											0,27
Общ. к-во ω3		0,25	0,27						0,28
C20:5n3									0,29
C22:6n3		0,26	0,28						0,27
ω 6/ ω 3
НЖК/ ПНЖК		-0,27	-0,27
(b)
НЖК
C16:0	0,42
C18:0		0,46	0,44				0,25		0,29
C20:0		-0,35	-0,30
C22:0		-0,29	-0,27
МНЖК
C18:1n7
C18:1n9											-0,25
ПНЖК				0,25		0,24
Общ. к-во ω6				0,29	0,27	0,31
C18:2n6c
C20:3n6	-0,24
C20:4n6
Общ. к-во ω3
C20:5n3	-0,26
C22:6n3		0,33	0,28
ω 6/ ω 3	-0,25
НЖК/ ПНЖК						-0,24

Таблица 8. Жирнокислотный состав мембран сперматозоидов, измеренный перед замораживанием в образцах, классифицированных в соответствии с криотолерантностью. Замороженный образец считался хорошим, если подвижность сперматозоидов в нем была >50% подвижности в свежей сперме.

	Хороший образец для замораживания	Плохой образец для замораживания
НЖК	42,29 ± 1,66	45 ± 0,76*
МНЖК	13,04 ± 1,3	14,71 ± 0,62
ПНЖК	44,67 ± 2,09	40,29 ± 0,75*
Общ. к-во ω6	16,63 ± 0,66	16,71 ± 0,36
Общ. к-во ω3	28,04 ± 2,64	23,58 ± 0,77*
DHA (C22:6n3)	25,28 ± 2,3	21,19 ± 0,69*
ω6/ ω3	0,66 ± 0,08	0,82 ± 0,06*
НЖК/ПНЖК	0,98 ± 0,07	1,17 ± 0,05*

*p<0,05

Список литературы

Adeel AL, Jahan S, Subhan F, Alam W & Bibi R. (2012) Total anti-oxidant status: a biochemical predictor of human male fertility. Andrologia 44 (Suppl 1), 20–25. Agarwal A & Sekhon LH. (2010) The role of antioxidant therapy in the treatment of male infertility. Hum Fertil (Camb) 13, 217–225. Agarwal A, Gupta S & Sikka S. (2006) The role of free radicals and antioxidants in reproduction. Curr Opin Obstet Gynecol 18, 325–332. Agarwal A, Makker K & Sharma R. (2008) Clinical relevance of oxidative stress in male factor infertility: an update. Am J Reprod Immunol 59, 2–11. Ahluwalia B & Holman RT. (1969) Fatty acid composition of lipids of bull, boar, rabbit and human semen. J Reprod Fertil 18, 431–437. Aitken RJ. (1989) The role of free oxygen radicals and sperm function. Int J Androl 12, 95–97. Aitken RJ. (1995) Free radicals, lipid peroxidation and sperm function. Reprod Fertil Dev 7, 659–668. Aitken RJ, Wingate JK, De Iuliis GN, Koppers AJ & McLaughlin EA. (2006) Cis-unsaturated fatty acids stimulate reactive oxygen species generation and lipid peroxidation in human spermatozoa. J Clin Endocrinol Metab 91, 4154–4163. Aksoy Y, Aksoy H, Altinkaynak K, Aydin HR & Ozkan A. (2006) Sperm fatty acid composition in subfertile men. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 75, 75–79. Alvarez JG & Storey BT. (1992) Evidence for increased lipid peroxidative damage and loss of superoxide dismutase activity as a mode of sublethal cryodamage to human sperm during cryopreservation. J Androl 13, 232. Alvarez JG & Storey BT. (1993) Evidence that membrane stress contributes more than lipid peroxidation to sublethal cryodamage in cryopreserved human sperm: glycerol and other polyols as sole cryoprotectant. J Androl 14, 199–209. Alvarez JG & Storey BT. (1995) Differential incorporation of fatty acids into and peroxidative loss of fatty acids from phospholipids of human spermatozoa. Mol Reprod Dev 42, 334–346. Alvarez JG, Touchstone JC, Blasco L & Storey BT. (1987) Spontaneous lipid peroxidation and production of hydrogen peroxide and superoxide in human spermatozoa. Superoxide dismutase as major enzyme protectant against oxygen toxicity. J Androl 8, 338. Anger JT, Gilbert BR & Goldstein M. (2003) Cryopreservation of sperm: indications, methods and results. J Urol 170, 1079–1084. Attaman JA, Toth TL, Furtado J, Campos H, Hauser R & Chavarro JE. (2012) Dietary fat and semen quality among men attending a fertility clinic. Hum Reprod 27, 1466–1474. Brotherton J. (1990) Cryopreservation of human semen. Arch Androl 25, 181–195. Calamera J, Buffone M, Ollero M, Alvarez J & Doncel GF. (2003) Superoxide dismutase content and fatty acid composition in subsets of human spermatozoa from normozoospermic, asthenozoospermic, and polyzoospermic semen samples. Mol Reprod Dev 66, 422–430. Centola G, Raubertas R & Mattox J. (1992) Cryopreservation of human semen. Comparison of cryopreservatives, sources of variability, and prediction of post-thaw survival. J Androl 13, 283. Chakrabarty J, Banerjee D, Pal D, De J, Ghosh A & Majumder GC. (2007) Shedding off specific lipid constituents from sperm cell membrane during cryopreservation. Cryobiology 54, 27–35. Chatterjee S & Gagnon C. (2001) Production of reactive oxygen species by spermatozoa undergoing cooling, freezing, and thawing. Mol Reprod Dev 59, 451. Conquer J, Martin J, Tummon I, Watson L & Tekpetey F. (1999) Fatty acid analysis of blood serum, seminal plasma, and spermatozoa of normozoospermic vs Asthernozoospermic males. Lipids 34, 793–799. Conquer J, Martin J, Tummon I, Watson L & Tekpetey F. (2000) Effect of DHA supplementation on DHA status and sperm motility in asthenozoospermic males. Lipids 35, 149–154. Gadea J, Molla M, Selles E, Marco MA, Garcia-Vazquez FA & Gardon JC. (2011) Reduced glutathione content in human sperm is decreased after cryopreservation: effect of the addition of reduced glutathione to the freezing and thawing extenders. Cryobiology 62, 40–46. Giraud MN, Motta C, Boucher D & Grizard G. (2000) Membrane fluidity predicts the outcome of cryopreservation of human spermatozoa. Hum Reprod 15, 2160–2164. Gosalvez J, Lopez-Fernandez C, Fernandez JL, Gouraud A & Holt WV. (2011) Relationships between the dynamics of iatrogenic DNA damage and genomic design in mammalian spermatozoa from eleven species. Mol Reprod Dev 78, 951–961. Gulaya NM, Margitich VM, Govseeva NM, Klimashevsky VM, Gorpynchenko II & Boyko MI. (2001) Phospholipid composition of human sperm and seminal plasma in relation to sperm fertility. Arch Androl 46, 169–175. Hammadeh ME, Askari AS, Georg T, Rosenbaum P & Schmidt W. (1999) Effect of freeze-thawing procedure on chromatin stability, morphological alteration and membrane integrity of human spermatozoa in fertile and subfertile men. Int J Androl 22, 155–162. Holoch P & Wald M. (2011) Current options for preservation of fertility in the male. Fertil Steril 96, 286–290. James PS, Wolfe CA, Mackie A, Ladha S, Prentice A & Jones R. (1999) Lipid dynamics in the plasma membrane of fresh and cryopreserved human spermatozoa. Hum Reprod 14, 1827–1832. Jeulin C, Soufir JC, Weber P, Laval-Martin D & Calvayrac R. (1989) Catalase activity in human spermatozoa and seminal plasma. Gamete Res 24, 185–196. Lapillonne A, Clarke SD & Heird WC. (2004) Polyunsaturated fatty acids and gene expression. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 7, 151–156. Lasso JL, Noiles EE, Alvarez JG & Storey BT. (1994) Mechanism of superoxide dismutase loss from human sperm cells during cryopreservation. J Androl 15, 255. Lenzi A. (1996) Lipids of the sperm plasma membrane: from polyunsaturated fatty acids considered as markers of sperm function to possible scavenger therapy. Hum Reprod Update 2, 246–256. Lenzi A, Gandini L, Maresca V, Rago R, Sgro` P, Dondero F et al. (2000) Fatty acid composition of spermatozoa and immature germ cells. Mol Hum Reprod 6, 226–231. Lenzi A, Gandini L, Lombardo F, Picardo M, Maresca V, Panfili E et al. (2002) Polyunsaturated fatty acids of germ cell membranes, glutathione and blutathione-dependent enzyme-PHGPx: from basic to clinic. Contraception 65, 301–304. Lepage G & Roy CC. (1986) Direct transesterification of all classes of lipids in a one-step reaction. J Lipid Res 27, 114–120. Lessig J, Gey C, Suss R, Schiller J, Glander HJ & Arnhold J. (2004) Analysis of the lipid composition of human and boar spermatozoa by MALDITOF mass spectrometry, thin layer chromatography and 31P NMR spectroscopy. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 137, 265– 277. Lewis SEM, Sterling ESL, Young IS & Thompson W. (1997) Comparison of individual antioxidants of sperm and seminal plasma in fertile and infertile men. Fertil Steril 67, 142–147. Li TK. (1975) The glutathione and thiol content of mammalian spermatozoa and seminal plasma. Biol Reprod 12, 641–646. Macı´as Garcı´a B, Gonza´lez Ferna´ndez L, Ortega Ferrusola C, Morillo Rodrı´guez A, Gallardo Bolan˜os JM, Rodrı´guez Martinez H et al. (2011) Fatty acids and plasmalogens of the phospholipids of the sperm membranes and their relation with the post-thaw quality of stallion spermatozoa. Theriogenology 75, 811–818. Mahfouz R, Sharma R, Sharma D, Sabanegh E & Agarwal A. (2009) Diagnostic value of the total antioxidant capacity (TAC) in human seminal plasma. Fertil Steril 91, 805–811. Maldjian A, Pizzi F, Gliozzi T, Cerolini S, Penny P & Noble R. (2005) Changes in sperm quality and lipid composition during cryopreservation of boar semen. Theriogenology 63, 411–421. Martinez-Soto JC, de DiosHourcade J, Gutierrez-Adan A, Landeras JL & Gadea J. (2010) Effect of genistein supplementation of thawing medium on characteristics of frozen human spermatozoa. Asian J Androl 12, 431–441. Martinez-Soto JC, Garcia-Vazquez FA, Gumbao D, Landeras J & Gadea J. (2011) Assessment of two thawing processes of cryopreserved human sperm in pellets. Cryobiology 63, 131–136. Mazur P. (1984) Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am J Physiol Cell Physiol 247, C125–C142. Miller RR Jr, Sheffer CJ, Cornett CL, McClean R, MacCallum C & Johnston SD. (2004) Sperm membrane fatty acid composition in the eastern grey kangaroo (Macropus giganteus), koala (Phascolarctos cinereus), and common wombat (Vombatus ursinus) and its relationship to cold shock injury and cryopreservation success. Cryobiology 49, 137–148. Miller RR Jr, Cornett CL, Waterhouse KE & Farstad W. (2005) Comparative aspects of sperm membrane fatty acid composition in silver (Vulpes vulpes) and blue (Alopex lagopus) foxes, and their relationship to cell cryopreservation. Cryobiology 51, 66–75. Nissen HP & Kreysel HW. (1983) Polyunsaturated fatty acids in relation to sperm motility. Andrologia 15, 264–269. O’Connell M, McClure N & Lewis SE. (2002) The effects of cryopreservation on sperm morphology, motility and mitochondrial function. Hum Reprod 17, 704–709. Oehninger S, Duru NK, Srisombut C & Morshedi M. (2000) Assessment of sperm cryodamage and strategies to improve outcome. Mol Cell Endocrinol 169, 3–10. Pen˜a F, Johannisson A, Wallgren M & Martinez HR. (2004) Antioxidant supplementation of boar spermatozoa from different fractions of the ejaculate improves cryopreservation: changes in sperm membrane lipid architecture. Zygote 12, 117–124. Poulos A & White IG. (1973) The phospholipid composition of human spermatozoa and seminal plasma. J Reprod Fertil 35, 265– 272. Rice-Evans C & Miller NJ. (1994) Total antioxidant status in plasma and body fluids. Methods Enzymol 234, 279–293. Romieu I, Garcia-Esteban R, Sunyer J, Rios C, Alcaraz-Zubeldia M, Velasco SR et al. (2008) The effect of supplementation with omega-3 polyunsaturated fatty acids on markers of oxidative stress in elderly exposed to PM2. 5. Environ Health Perspect 116, 1237. Safarinejad MR. (2011) Effect of omega-3 polyunsaturated fatty acid supplementation on semen profile and enzymatic anti-oxidant capacity of seminal plasma in infertile men with idiopathic oligoasthenoteratospermia: a double-blind, placebo-controlled, randomised study. Andrologia 43, 38–47. Safarinejad MR, Hosseini SY, Dadkhah F & Asgari MA. (2010) Relationship of omega-3 and omega-6 fatty acids with semen characteristics, and anti-oxidant status of seminal plasma: acomparison between fertile and infertile men. Clin Nutr 29, 100– 105. Schiller J, Arnhold J, Glander HJ & Arnold K. (2000) Lipid analysis of human spermatozoa and seminal plasma by MALDI-TOF mass spectrometry and NMR spectroscopy - effects of freezing and thawing. Chem Phys Lipids 106, 145–156. Smith R, Vantman D, Ponce J, Escobar J & Lissi E. (1996) Andrology: total antioxidant capacity of human seminal plasma. Hum Reprod 11, 1655– 1660. Swain JE & Miller RR. (2000) A postcryogenic comparison of membrane fatty acids of elephant spermatozoa. Zoo Biol 19, 461–473. Tavilani H, Doosti M, Abdi K, Vaisiraygani A & Joshaghani HR. (2006) Decreased polyunsaturated and increased saturated fatty acid concentration in spermatozoa from asthenozoospermic males as compared with normozoospermic males. Andrologia 38, 173–178. Tavilani H, Goodarzi MT, Doosti M, Vaisi-Raygani A, Hassanzadeh T, Salimi S et al. (2008) Relationship between seminal antioxidant enzymes and the phospholipid and fatty acid composition of spermatozoa. Reprod Biomed Online 16, 649–656. Therond P, Auger J, Legrand A & Jouannet P. (1996) Alpha-tocopherol in human spermatozoa and seminal plasma: relationships with motility, antioxidant enzymes and leukocytes. Mol Hum Reprod 2, 739–744. Thomson LK, Fleming SD, Aitken RJ, De Iuliis GN, Zieschang JA & Clark AM. (2009) Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod 24, 2061–2070. Thurston L, Watson P, Mileham A & Holt W. (2001) Morphologically distinct sperm subpopulations defined by Fourier shape descriptors in fresh ejaculates correlate with variation in boar semen quality following cryopreservation. J Androl 22, 382. Thurston LM, Siggins K, Mileham AJ, Watson PF & Holt WV. (2002) Identification of amplified restriction fragment length polymorphism markers linked to genes controlling boar sperm viability following cryopreservation. Biol Reprod 66, 545–554. Wang AW, Zhang H, Ikemoto I, Anderson DJ & Loughlin KR. (1997) Reactive oxygen species generation by seminal cells during cryopreservation. Urology 49, 921–925. Waterhouse K, Hofmo P, Tverdal A & Miller R Jr. (2006) Within and between breed differences in freezing tolerance and plasma membrane fatty acid composition of boar sperm. Reproduction 131, 887. White IG. (1993) Lipids and calcium uptake of sperm in relation to cold shock and preservation: a review. Reprod Fertil Dev 5, 639. WHO (2010) WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen, 5th edn., p. 286. World Health Organization, Geneva, Switzerland. Zalata AA, Christophe AB, Depuydt CE, Schoonjans F & Comhaire FH. (1998) The fatty acid composition of phospholipids of spermatozoa from infertile patients. Mol Hum Reprod 4, 111–118. Zini A & Al-Hathal N. (2011) Antioxidant therapy in male infertility: fact or fiction? Asian J Androl 13, 374–381. ©

Корреспонденция: Хоакин Гадеа, кафедра физиологии, школа ветеринарной медицины, Университет Мурсии, Кампус Маре Нострум, Мурсия 30 100, Испания. Joaquin Gadea, Department of Physiology, School of Veterinary Medicine, University of Murcia, Campus Mare Nostrum, Murcia 30 100, Spain. E-mail: Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.